如何從尿液樣本内提取高純度的外泌體?

如何從尿液樣本内提取高純度的外泌體

ISOLATING EVs FROM URINE USING qEV

提取尿液樣品中外泌體的建議與要點

尿液是一項包含各種大範圍的胞外體/細胞外囊泡(EVs)的重要的生物流體, 包含微泡(micro-vesicles)和凋亡小體。
對於尿蛋白組和轉譯組的生物標記物的開發而言, 尿液EVs是一個好的非侵入性來源; Size Exclusion Chromotagraphy (SEC) 尺寸排阻色譜法是一種非常廣泛的技術, 以各種生物流體中的不同粒徑來分離分子內的複合混和物。
而 IZON qEV 的提取是一種可靠而標準化的技術, 可從尿液中純化EVs(細胞外囊泡); 這可用於提前發現泌尿系統的疾病或腫瘤和其相關進展。

IZON's Automatic Fraction Collector (AFC) 外泌體自動餾份收集機可將 qEV 提取的過程自動化, 減少人為錯誤以實現高精度和簡化的工作流程。

注意和推薦事項

qEV前的樣品濃縮

尿液通常需要適當的濃縮以達到EVs的檢測產量, 其裝置的尺寸和型號會依據樣品的體積而定。
- 離心式濃縮管適用於體積小的樣品 (Protein Ark / Amicon Ultra); 切向或交錯流動裝置適用於體積大的樣品 (Pellicon / Minimate)
- 相關報導指出, 以 100 kDa 純化的Exosome會比 10 kDa 的純度還高
- 壓力驅動的切向流濃縮因其有更高的流速而會更適於400 mL以上的體積, 外泌體(exosome)的損失只會在前50-100 mL的樣品中

樣品處理
- Tamm-Horsfall Protein (THP)被稱為尿調節蛋白, 也是正常人的尿液中含量最豐富的蛋白, 其單體蛋白約為85 kDa但在尿液中可以高達數百萬daltons的巨大團聚形態存在。
當尿液特別是在低pH環境下濃縮時, THP會形成一個膠體而會在低速離心的過程中捕捉尿液的外泌體
- 尿液樣品於200 mg/mL的dithiothreitol(DTT)下以37℃孵化10分鐘並以17,000g離心10分鐘即可移除THP

qEV column上樣
- 輸入比建議值大的樣品體積會導致在其後的囊泡體積中降低純度水平、在蛋白與EV沖提峰中有更高的重疊和在EV區中有更高的蛋白水平

使用 qEV columns 提取尿液內的EVs的圖示

表1: 推薦和適合qEV columns的體積

材料

尿液收集管

可達17,000xg的離心裝置

Micro-pipettes 微量移液器

新鮮的1X PBS溶液

無菌的0.22µm過濾器

無菌的注射器

Izon 的 qEV Columns (胞外體提取管柱)

Izon 的 Automatic Fraction Collector (自動提取機)

方法

1. 準備新鮮的 1X PBS 溶液並用無菌的0.22µm過濾器進行過濾

2. 使用室溫的PBS溶液平衡qEV column
2.1 除氣和室溫的緩衝液將有助於避免在凝膠床中形成氣泡

3. 收集尿液樣品並在180xg, 4℃下離心10分鐘, 接著以1,550xg, 4℃下離心20分鐘; 在離心步驟之間轉移上清液至其他空管中, 小心不要破壞顆粒

4. 將無細胞和碎屑的尿液樣品濃縮至表1建議的qEV的輸入體積

5. 在400 mL體積內推薦使用 Protein Ark / Amicon Ultra 和 Centricon Plus-70 離心裝置; 如有更大的體積, 使用 Pellicon / Minimate 切向流裝置

6. 如果濃縮的樣品帶有黏性, 在輸入qEV前可使用建議的DTT孵化步驟以移除THP

7. 將樣品體積對應的適合大小的qEV放置於AFC或qEV Rack上接著輸入樣品
7.1 確認樣品體積所對應的qEV column型號正確

8. 開始收集空隙體積和樣品餾份
8.1 不同的樣品可能會有輕微不同的冲緹曲綫和純度, 建議對所收集的餾份中的EVs濃度和蛋白質污染物進行初步測量

9. 完成收集EV體積後, 以至少1.5倍管柱體積的緩衝液流洗管柱 (在輸入其他樣品前或儲存管柱以繼續使用)

10. 尿液EVs已準備好進行下游應用, 建議使用TRPS技術來分析以標準化EV的鑑定和定量 (粒徑, 濃度和表面電位)