qEV Column (SEC) 胞外體提取管柱
符合ISO13485:2016品質規範 | 樣品直接自然滴落 | 15分鐘內完成 | 最純淨無損的方式 | 管柱洗脫後可重複使用
qEV Column 胞外體提取管柱 (全新發售 "Gen 2" 型號已發佈) [原廠YT介紹和示範短片請見頁底]
近年來, 胞外體/細胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的研究越來越引起相關生物學者的關注, 因為它們可擔任細胞間訊息傳導的角色: 包含免疫調節、細胞的活化與凋亡誘導以及在疾病狀態下的改變, EVs 的內容物有外泌體(Exosome, 外泌體/胞泌體)、微囊泡(Microvesicles)、外吐小體、胞外小體等。
因此, 如何提取和分析高含量與高純度的 EVs 就變成一個必要的過程(Exosomes/EVs isolation)。
還在用傳統的純化提取方法嗎?
傳統一般會使用的高速離心法(UC)或沉澱原理的試劑組(Precipitation Reagent Kits)常會遇到一些問題, 比如高速離心過程很花時間, 在 20,000g 的作用力下常會破壞囊泡或使囊泡團聚而影響後續的分析, 而使用密度梯度離心法 (Density gradient centrifugation, DGC) 會需要很昂貴的設備也很費時; 目前市面上以沉澱原理的試劑組通常是基於PEG高分子聚合物而對沉積胞外體有選擇性, 但相關文獻早已指出這些試劑的成分很大可能會引起蛋白質、脂蛋白和其他生物成分的共沉澱現象出現。
現在就選擇qEV column吧
IZON Science的 "Gen 2" qEV column 胞外體提取管柱, 製造過程符合ISO13485認證, 可得到非常純淨的胞外體(外泌體)粒子, 純度可高達約1.0E+10個粒子/每µg雜蛋白 (以10mL人類血漿樣品量為例, 相當於1.0E+13個粒子於每mg的雜蛋白中), 相較之前舊版的 Legacy qEV column 具有更為優化的表現。
SEC 尺寸排阻色譜法
MISEV指南: 相對容易的使用方式, 可乾淨有效的分離EVs和Protein, 使用自動系統可減少人為之間的誤差
qEV Columns 胞外體提取管柱是基於 SEC (Size Exclusion Chromatography) 尺寸排阻色譜法, 又名凝膠排阻法(Gel Filtration) - 可提供快速簡單而精準有效的胞外體提取方式, 以"自然滴落"的方式在15分鐘內即可提取完整的胞外體純樣, 大粒徑的粒子會先流出, 相對的小粒徑(35nm或70nm以下)的粒子會進入到孔洞內而較晚流出, 比採用傳統的高速離心 (UC) 或沉澱試劑 (Precipitation Reagent Kits) 的方式更加能純淨、簡單、快速、精確而無損的提取胞外體, 更適合後續的下游分析例如Tunable Resistive Pulse Sensing, Electron Microscopy, Proteome or Transcriptome Analysis, 搭配 qEV Concentration Kit 和 qEV RNA Extraction Kit 更是串聯一體化的流程。
qEV Columns 依照進樣體積的不同已經有 6 個型號 (150µL - 100mL), 每個型號都有35奈米和70奈米兩種孔徑可以選擇, 可完全覆蓋您的原始樣品類型, 使用 PBS 或是其他生理緩衝液洗脫管柱後可重複使用。
現在, qEV 還可以選擇全球第一的自動提取裝置 (AFC-V2, Automatic Fraction Collector)。
"Size-exclusion chromatography using commercially available columns may be a relatively easy way to separate EVs from soluble proteins, lipoproteins (although probably not LDLs) and nano-sized NVEPs etc., in order to determine whether EVs are the main carrier of the analyzed biomarker." --- «MISEV 2022 draft»
各種適用的生物樣品
血清、血漿、唾液、尿液、乳液、細胞培養上清液(預濃縮)、CSF腦脊髓液、生物反應器等各種樣品來源
qEV Gen 2 Column (SEC) 可移除>97%的污染可溶性蛋白
舉例: 使用 qEVoriginal Gen 2 column 滴入0.5 mL 血漿的典型洗脫曲線 (PCV: Purified Collection Volume = EV zone)
全球唯一, 管柱生產過程品質可靠證明
符合 ISO 13485:2016 規範
qEV(SEC) + Exoid(TRPS) is now the Gold Standard for exosome/EV isolation
qEV Columns Gen 2 規格
1. 管柱類型(sample loading volume): qEVsingle/qEVoriginal/ qEV1/qEV2/qEV10/qEV100
2. 操作溫度 : 18-24 ºC
3. 分離的粒徑孔洞 : 35 nm or 70 nm nominal
4. Buffer種類 : All qEV columns come equilibrated in PBS buffer
5. 可通過的最大粒子粒徑 : 1 µm
6. 頂部與底部的過濾器尺寸 : 20 µm
7. 可穩定運作的pH值範圍 : 3-13
8. 可穩定流洗清潔的pH值範圍 : 2-14
9. 正確保存下的使用週期 : 12 months
※ 全新改良型的 Agarose resin 填充的 "Gen 2" 型號的columns 已開始發售, 可大幅提升回收率與純度
如何選擇您的 qEV Columns 胞外體提取管柱? 只要三步驟就好
第一步 : 依照樣品的體積 (Sample Loading) 選擇適合的型號
(*如原樣為細胞上清液, 建議先以100 kDa Concentrator / TFF system 濃縮30X-200X體積, 詳見"外泌體實驗知識與流程-如何從細胞上清液提取高純度的胞外體"):
| 型號 | 進樣體積 | 數量 | 使用 |
|---|---|---|---|
|
qEVsingle Gen 2
|
100-150 µL
|
20支/盒
|
single use
|
|
qEVoriginal Gen 2
|
500 µL
|
5支/盒
|
reuse
|
|
qEV1 Gen 2
|
1 mL
|
||
|
qEV2 Gen 2
|
2 mL
|
2支/盒
|
|
|
qEV10 Gen 2
|
10 mL
|
1支/盒
|
|
|
qEV100 Gen 2
|
100 mL
|
第二步: 選擇35 nm或70 nm的孔徑
最佳的粒徑回收範圍 (Optimum recovery range) -
qEV/35nm: 35-350 nm (粒徑下限小, 適合提取Small EVs的粒子)
qEV/70nm: 70-1000 nm (粒徑範圍廣, 適合提取整體EVs的粒子, 包含Microvesicles)
第三步: 下游的WB, MS, qPCR分析? 繼續使用 "qEV Concentration Kit" ; 下游的EV-RNA分析? 繼續使用 "qEV RNA Extraction Kit" ; 直接做粒徑分析? 使用最精準的 "Exoid (TRPS) 奈米粒徑/濃度/zeta電位分析儀"
想要EVs粒子的濃度?EVs粒子的回收率?還是EVs粒子的最大純度?, 由用戶決定的"EV zone"自訂義操作
以qEV10/35nm Gen 2 column使用10 mL人類血漿(human plasma)樣品為例, 滴落的流洗曲線如圖; 雜蛋白粒子會比胞外體粒子(EVs, 或相似的60 nm大小的粒子)流洗的更晚出現; 粒子濃度是以TRPS原理的Exoid粒徑分析儀得出, 蛋白水準由BCA測定得出。
大部分的EVs粒子會在Buffer Volume後的20 mL中出現, 就是所謂的EV zone(PCV: Purified Collection Volume); 如果要求的是更好的"純度", 那就只要收集前15 mL的滴落體積就好; 用戶也可以收集更多的滴落體積以達成"最大回收率", 或是收集少一些的體積以達到"最大純度"。
以血漿樣品為例, 雜蛋白會在後面的體積中流洗出來, 大約是在Buffer Volume後的25-70 mL內出現; 所以在20 mL之後就要小心, 除了囊泡之外會有更高的蛋白汙染物出現, 進而影響之後的下游分析實驗(EV的純度越低)。
qEV10 Gen 2 column的不同流洗的建議參數表, 選擇適合您的純化收集體積吧(PCV, Purified Collection Volume); 此表是以人類血漿樣品為例(human plasma), 其他樣品類型可能會有略為不同的流洗曲線。
選擇1: 如為要求EVs粒子的濃度: 拉高Buffer Volume, 收集之後的3個fractions為EV zone
選擇2: 如為要求EVs粒子的回收率: 維持Buffer Volume, 收集之後的7個fractions為EV zone
選擇3: 要求EVs粒子的最大純度: 維持Buffer Volume, 收集之後的3個fractions為EV zone
具體操作: 使用AFC-V2自動提取機的預設值(維持Buffer Volume), 收集之後的4個fractions為EV zone
如使用不同型號的qEV column還請參閱完整版的用戶使用手冊內容或詢問我們的專員。
Q&A 1. 使用 qEV Columns 提取 Exosome/EVs 時需要做什麼前置作業嗎? Ans: 採用SEC尺寸排阻色譜法的qEV Columns在使用前只需注意要先將樣品進行兩次步進的低速離心 - 1,500g/10mins, 將上清液移至新Eppendroff後, 再使用 10,000g/10mins 取上清, 以上的目的是要去除樣品內的細胞碎屑或其他的大粒子, 之後即可放入 qEV Columns 以自然滴落的方式得到Exosome/EVs的餾分(fractions)。 2. 已經使用過的qEV Columns要怎麼封存/保存呢? 所使用的Buffer有什麼注意事項呢? Ans: 新的qEV Columns有加入0.05% w/v sodium azide做抑菌劑 (with PBS)所以可於室溫下保存/運輸; 而已用過並elution後的qEV column, 封存方式有三種: 1. 以0.05% w/v sodium azide(with PBS)封存, 即可在室溫保存; 下次使用時一樣要先做"equilibrate"平衡的動作, 以2倍column體積的Buffer流洗管柱。 2. 使用20% ethanol封存, 可在室溫保存; 因PBS如果直接接觸乙醇會形成結晶而堵塞管柱, 所以要先以DI water流洗2xcolumn volume後再放入乙醇, 下次使用前一樣要先用DI water流洗後再放入PBS buffer做平衡。 3. 如只加入PBS封存, 則建議放4-8度冷藏下保存(不可冷凍); 但一定需要注意PBS要經過degas & filtered, 避免下次取出在室溫下時因為溫差而析出小氣泡於管柱內影響使用。 請注意, 實驗過程中所用到的PBS buffer都應經過0.22um filtered & Degas除氣(可使用負壓泵接錐形瓶形成管路的負壓系統抽氣, 或退其次以超音波震盪15分鐘以上), 以避免在column的resin中析出氣泡。 3. 我的原樣體積很大(ex: 細胞上清液), 該使用何種 qEV Columns 呢? Ans: 現在qEV Columns的型號最大為qEV100(sample loading 100 mL), 如果要使用 AFC-V2 自動提取機的最大型號則為qEV10(10 mL); 關於細胞上清液(Cell Culture Media)的原始體積量範圍已可達4-5L, 只需先使用100 kDa濃縮管(或TFF)預先縮小體積, 相關流程請參閱實驗應用專區-如何從細胞上清液内提取高純度的細胞外囊泡 4. 經由qEV column後的fractions, 要如何做下游測試例如Western 西方墨點法? 可否每個fraction單獨進行? Ans: 因為qEV是以SEC原理進行純化, 可區分為EV zone和非EV zone; 流洗出的總體積會比原樣還大, 代表需要經過後製濃縮(使用qEV Concentration Kit)才會有把握的分析結果; 而qEV column的elution流洗曲線中所設定的fraction, 是用來設計EV zone為"純度"或"回收率"或"濃度"為考量的微調設定, 不可直接以單獨單一的fraction進行下游WB分析來比較, 而是需要將設計的EV zone先做"合併餾份(pooled fractions)", 再經由qEV Concentration Kit進行濃縮富集EVs成pellet後再開始WB分析。
更多的相關訊息, 歡迎和我們聯絡或來信洽詢: info@normanda.com
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