qEV Concentration Kit (qEV 胞外體濃縮試劑盒)

qEV Concentration Kit (qEV 胞外體濃縮試劑盒) [原廠YT介紹和示範短片請見頁底]

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眾所周知, 關於 Exosome/Extracellular Vesicles (EVs) 的純化/提取步驟可用以富集 EVs 粒子, 也是其影響純度的關鍵要素; 而以 qEV Columns (SEC) 的純化過程已被證實能提供快速可靠而標準化的高純度 EV 粒子, 但要注意的是在進行下游分析前(WB, ELISA, Mass, qPCR等), 需要將其 EV 的 fractions 進行濃縮使其濃度放大
關於後濃縮的方式, 一般會先想到用超濾膜的方式進行反覆離心來進行, 然而其缺點在於這並不是專為 EV 的粒子大小為出發點所考量的設計, 可能會出現濃縮倍率的受限和 EVs 粒子沾附在膜上所造成的損失, 在離心的過程中也可能危及到 EV 的完整性, 以上風險都會導致 EVs 粒子和其所帶的"貨物"的損失

相對來說, qEV Concentration Kit (qEV 胞外體濃縮試劑盒) 是一個 All-in-One 系統, 可將 qEV columns (SEC) 的 EVs isolated fractions (pooled 體積範圍: 600 μL~20 mL) 輕易的濃縮成 pellet (顆粒), 大幅減少操作人員的負擔; 不需要特殊的設備, 不使用沉澱性的反應物或蛋白酶處理, 每次試劑的使用量只需 50 µL - 200 µL, 有效節省時間與預算成本
所濃縮的 EVs 可用來進行下游應用包含: Western, Mass Spec, qPCR, microarray analysis, small RNA sequencing (RNA-seq)。
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qEV Concentration Kit (qEV 胞外體濃縮試劑盒) 的原理

Nanotrap® particles

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qEV Concentration Kit 內含一瓶 5 mL Ceres Nanosciences Nanotrap® Extracellular Vesicle Particles, 是由大約 260 nm 大小的水凝膠粒子所組成的懸浮試劑溶液, 主要成分為 thermostable cross-linked N-isopropylacrylamide (NIPAm) polymers, 耐熱交聯 N-異丙基丙烯酰胺 (NIPAm) 聚合物, 已被報導証實其可在不同的溫度及pH值的條件下將較小的目標分析物保留下來

Nanotrap® EV Particles 的顆粒表面還帶有化學親和性的"誘餌", 使其可特異的結合 EV 粒子; 如左圖所示:
Structure and capture mechanism of Nanotrap® EV Particles present in qEV Concentration Kit.
Nanotrap® EV Particles are ~260 nm (measured by tunable resistive pulse sensing using the Exoid) particles made of polymer functionalised with baits with high affinity to EVs.。

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相較於其他類似包膜病毒的生物性奈米結構物, Nanotrap® EV Particles 的特殊化學親合性誘餌是已被修飾為對 EVs 粒子具有顯著的更高親和性
如左圖, 以腫瘤細胞上清液為例, 在 Jurket (未感染的人類 T 細胞嗜淋巴細胞病毒 1 型 HTLV-1)與 HUT102 (已感染 HTLV-1) 細胞系中, 外泌體陽性標記 CD63, Alix 和陰性的 Actin 的 Western Blot 對照, 顯示出在 Nanotrap® EV Particles 的親和性誘餌 (NT80) 可與外泌體型的 EV 鍵結, 而其他對於病毒的特異性誘餌 (例如 NT86) 則沒有

當然 Nanotrap® EV Particles 是以不可逆的方式與 EVs 鍵結, 雖然其沒有可用於分離完整 EV 的洗脫方式, 但可使用 EV 的裂解過程來釋出與 EV 相關的"貨物"; 在與 Nanotrap® EV Particles 進行鍵結時, EV 的結合位點並不是飽和的, 這表示如果需要這些 EV 的位點時, 可進行相關的標記或染色分析

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當使用了 qEV Concentration Kit 後, 已被純化的 EV fractions 會被進行高效的濃縮並用來進行下游的分析, 但其目的卻"不是用於定量 EVs 粒子"; 相對的是其聚焦於低豐度的特異 EV 標誌物尋找和定量, 包含 RNA 萃取以用於基於 PCR 的測定法的分子表徵、RNA定序研究或 ELISA, WB 和 Mass 光譜的蛋白製備。

如左圖是 qEV Concentration Kit (Nanotrap) 和超濾法 (Amicon) 的比較, 先使用了 qEV2/35nm column 純化出血漿的 EVs 後, 使用兩種不同方式進行後濃縮, 接著重懸於600 µL 緩衝液中, 最後以 qEV RNA Extraction Kit (qEV 胞外體-RNA 萃取試劑組) 將 RNA 萃取出。使用 SYBR 法增益 EV-RNA 的 mRNA 目標物, 圖示的結果為使用 qEV Concentration Kit 會在濃縮後定量到更多的 mRNA 目標物, 而其目標的訊號可再被進一步藉由重懸濃縮於更少的緩衝液或直接將 EV pellet  用於下游應用的緩衝液中來改進
重要的是, 如果是用以乙醇基底的裂解緩衝液時, 可能會降低與 Nanotrap 粒子鍵結的 EVs 的裂解效率, 因此初始程序的推薦是使用無乙醇的裂解緩衝液

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