[胞外體(細胞外囊泡)的類型: 從”外泌體”到”癌小體”和介於兩者之間的分類]

簡介: 什麼是胞外體/細胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs), 什麼是外泌體(exosome)呢? 可能與你想像的不同。在這裡, 我們會深入的介紹EVs的亞型和標記物, 以此來區分它們。

在胞外體(EV)研究人員的某些圈子中, ”外泌體(exosome)”一詞已經成為一個非常容易混淆的詞。造成這種現象的原因是多方面的, 但最主要的原因是”命名法則”以及僅根據其大小來定義囊泡(Vesicles)的缺陷。然而, 儘管國際細胞外囊泡學會(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)[1]做出了極大的努力, 但這個名詞在各種說法中一直很流行, 儘管在ISEV相關的出版物中已經一直在澄清中, 研究人員使用“外泌體”這個術語可能是因為它太容易辨識了, 或者可能是因為大眾已經習慣了吸引眼球的詞彙。其他人可能在討論”小胞外體”(sEV)時會使用“外泌體”替代, 卻沒有意識到在他們的分離物中可能有非外泌體的胞外體粒子。這就引出了一個問題 -- 外泌體到底是什麼? 它與其他EV有什麼不同?

外泌體和其他胞外體的亞型, 以及它們形成的方式
胞外體(EV)是指任何(細胞外)的囊泡, 其具有雙層膜並包含隨機的或者可特定反映某種細胞狀態的細胞內容物, 並由細胞“自然”產生(即不是通過擠壓細胞人為產生)。這一定義包括多種的胞外體亞型, 其中許多可能尚未發現或被確定其特徵。在此, EV領域的一個主要限制是: EV的特性是”混雜”的。各亞型在大小、組成和密度上有重疊的地方, 使它們幾乎無法完美區分。它們的生物起源確實不同(圖1), 而這是定義它們的唯一條件。不幸的是, 除非這條起源路線被目擊到, 否則幾乎不可能為一種EV指定一條生源路線, 也就是說, ”外泌體”必須被看到其生成的過程才能被相信。

圖1所示為胞外體(EV)生物發生的不完全示意圖。從頂部開始，膜內陷形成胞內體(endosome), 這是一個細胞內的間隔, 可以走向不同的命運之一。在這裡，我們展示了向晚期胞內體的轉變, 晚期胞內體可以成熟為多泡體(MVB), 腔內囊泡內陷到MVB中。然後MVBs與質膜融合, 釋放這些腔內囊泡, 這些囊泡現在被稱為外泌體(exosome)。我們還可以看到遷移細胞在長而薄的膜突起上留下的遷移體(migrasome)。遷移體的球形腫脹可能會脫落或惡化而釋放其腔內囊泡。
接下來是微囊泡(microvesicles), 體積既可小(大小與外泌體重疊), 也可大(幾乎和細胞碎屑差不多), 它們直接從質膜上產生。
至於分泌性自噬小體 (secretory autophagosome), 在這裡，一個雙層包裹的自噬小體與質膜融合, 釋放出一個單層的分泌性自噬小體, 可能包含整個細胞器。接下來我們來看看細胞凋亡的產物。凋亡小體 (Apoptotic bodies) 既直接從膜泡形成, 也直接從凋亡或微管棘突形成。當凋亡細胞撤退時, 也會留下珠狀的凋亡偽足。
目前描述的最大的EV是合胞節, 它是直接從胎盤的合胞滋養層表面發芽的細胞核集合。最後一種是癌小體 (oncosome), 像凋亡小體或微泡一樣直接從細胞膜上出芽, 但具體來源於癌細胞, 且通常體積更大。

那麼, 這些難以捉摸的外泌體(exosome)到底是什麼? 外泌體是直徑約為30 ~ 150 nm大小的小EV。外泌體的直徑可小至30 nm, 而10 ~ 20 nm是脂質雙層囊泡的最小大小, 因此這也是EV大小的下限[2]。也就是說, 如果你要測量比它小的東西, 它就不是EV。外泌體是由晚期胞內體內陷形成腔內囊泡(ILV)並使晚期胞內體形成多泡體(MVB)而產生的。然後MVB與質膜融合, 釋放外泌體(之前以腔內囊泡的形式存在)到細胞外空間, 如圖1所示。
另一方面, 微囊泡(microvesicles)直接從質膜向外發芽, 並且往往體積更大。微囊泡又被稱為核外顆粒體或微粒, 其大小與外泌體重疊並一直延伸到直徑超過一微米。
當質膜出芽的EVs在細胞凋亡的背景下發生時, 這些被稱為凋亡小體(apoptotic bodies)。這些凋亡的EVs可能甚至比微囊泡更大, 但可能會載有獨特的貨物, 包括完整(或碎片)的細胞器和大量碎片化的遺傳物質。
許多其他亞型一般也在細胞中常見, 也存在於特定情況下(見圖1)。例如: 包括神經元釋放的突觸囊泡, 或胎盤釋放的脫落合胞節(shed syncytial knot); 後者從胎盤釋放, 從多核合胞滋養細胞中去除細胞核團(圖1左側)[3]。圖1中顯示的許多EV類型還未得到充分研究, 而且所有EV(包括外泌體和微囊泡)都知之甚少。事實上似乎我們對這些有趣的囊泡研究得越多, 就越意識到我們對它們瞭解甚少。在過去的幾年裡, 有一種無知的自信讓我們相信我們可以區分外泌體和微囊泡。但最近, 這一點似乎越來越不確定。

EV亞型的真正特異性標誌物可能不存在
這麼說可能有點難以置信, 但它是有文獻支持的。雖然曾經認為某些細胞成分是針對不同EV亞型的, 但對EV生物發生和釋放的細胞生物學研究使這一觀點受到質疑。然而, 外泌體的真正標誌物在某種程度上是該領域的聖杯, 因為人們(無論正確與否)癡迷於研究EV的外泌體成分。在使用尺寸排阻法分離富含小EV上清液前, 他們通過超速離心沉澱較大EV, 然後0.22µm過濾。具有諷刺意味的是, 許多名為“外泌體提取”的商業試劑盒並不是專門針對這種亞型的。然而, 這個名字在該領域幾乎令人上癮。怎麼知道EV是外泌體呢? 初步的答案是你可能無法完全保證。
轉運所需的胞內體分選複合物(ESCRT)蛋白曾被認為對外泌體具有特異性。線索就在它們的名字裡, 人們認為它們是胞內體, 所以只能存在於外泌體中。不幸的是，事實證明並非如此。ESCRT I、II和III蛋白複合物及相關蛋白(甚至長期以來被認為是外泌體標誌物的TSG101)參與了微囊泡從質膜出芽以及ILV出芽到MVB[4-6]。
ESCRT-0複合體可能(這裡強調為“可能”)具有胞內體特異性, 使其組分成為外泌體的潛在標誌物。有證據表明, 基因敲除降低兩種ESCRT-0蛋白的表達減少了CD63+ve的小EV的釋放。因此, CD63是外泌體來源的, 是這樣嗎?
這可能是錯誤的。CD9、CD81和CD63等四跨膜蛋白長期以來一直被吹捧為外泌體標誌物, 但它們也存在於微泡上[6]。具體而言, Mathieu等人(2021)的一項研究發現, CD63和CD9均為陽性的EVs至少有部分是質膜出芽(因此是微囊泡), 而CD63+ve/CD9-ve的EVs最有可能是外泌體。再次強調是“可能”。
那麼syntenin-1呢? 由於其參與了ESCRT相關蛋白Alix的募集, 因此被建議作為外泌體標誌物。它也存在於CD63+ve/CD9+ve的EV中, 但至少在CD63+ve 的EV中富集[6]。因此, 雖然syntenin-1可能在外泌體中富集, 但它可能不足以作為外泌體的標記物。
當然, 經常被用作外泌體標記的Alix本身經得起推敲麼? 不幸的是沒有。研究發現Alix在CD63+ve和CD9+ve EVs中存在的可能性相同[6], 這表明Alix可能不具有外泌體特異性。
Mathieu等人(2021)將LAMP1和/或LAMP2確定為潛在的外泌體標誌物[6]。LAMPs是溶酶體的標記物, 在CD63+ve EVs中的表達顯著高於CD9+ve EVs。可信的外泌體標記物嗎？也許吧…
再次值得強調的是, 已經使用的外泌體標誌物可能被確定為非特異性。但Mathieu等人(2021)的研究僅使用了一種細胞類型, 即有爭議的HeLa細胞, 因此結果尚不能完全推廣到不同的細胞類型。在不同的細胞類型中重複這些發現會使它們更可信。

外泌體抑制劑和刺激劑: 是有用的工具還是誤入歧途?
GW4869是中性鞘磷脂酶抑制劑, 可抑制神經醯胺依賴的ILVs向MVBs出芽[10]。至少在理論上是這樣。這使得GW4869在許多研究中被用作“外泌體抑制劑”。實際上這一機制可能根本不是外泌體特有的。Mathieu等人(2021)的研究表明, 常用的“外泌體抑制劑”GW4869對CD63+ve/CD9-ve類似外泌體的分泌幾乎沒有影響, 作者建議謹慎使用。
相反, “外泌體刺激劑”巴佛洛黴素A1通過抑制空泡ATP酶來抑制晚期胞內體的酸化。據報導, 這可能會增加外泌體的分泌[6]。然而, 雖然這在某些情況下可能有用, 但重要的是要承認, 改變晚期胞內體的pH值可能會改變外泌體的貨物裝載, 在使用該藥物操縱外泌體的分泌之前, 應該先研究清楚這一點。

這對EV領域意味著什麼?
它至少意味著幾件事。首先, 人們在使用“外泌體”這個名詞時應該更加謹慎。這是一個很棒的詞, EV領域之外的人也認識它, 但這並不意味著它得到了更多的引用。它不是, 可見圖2的證據。


圖2. 使用外泌體和胞外體的論文引用。當比較每年被引論文的百分比或領域被引率(即每篇論文的被引率, 根據每年每個領域發表的論文進行調整)時, 在論文標題或摘要中帶有“exosome”或EV的論文被引的方式方面幾乎沒有差異。

其次, 這意味著需要更多的研究。最好使用多種細胞系並使用多種不同的技術進行分離和鑒定。只有這樣, 我們才能確定外泌體標記物(無論是LAMP蛋白還是其他蛋白)是否真的是外泌體蛋白。即便如此, 使用這些蛋白質進行免疫捕獲也存在固有缺陷。我們不知道每個外泌體都會包含任何給定的標記。只選擇那些蛋白會產生不知情的偏見。

參考文獻