[為什麼要選擇Exoid分析奈米粒徑的四個理由]

只能用NTA來分析外泌體(EVs)的粒徑數量嗎? NTA的結果真的可靠嗎?

說到奈米粒徑分析, 雖然大家一開始都會聯想到以”optical method”的NTA原理(Nanoparticle Tracking Analysis); 然而在很多文獻中已經表明了使用雷射原理會有的缺陷, 比如Hydration effect水和效應、camera level, thresholds, refractive index參數設定會有的偏差結果。

IZON Science的Exoid 是最新一代的TRPS原理(Tunable Resistive Pulse Sensing), 屬於”Non-optical method”的範疇, 可分析電解質緩衝液中奈米粒子的濃度、粒徑和zeta電位。這些奈米粒子可以是從患者血漿中分離出的胞外體(Extracellular vesicles, EVs), 也可以是裝載疫苗的脂質奈米粒子[1], 甚至可以用來測量細菌。

"TRPS is a non-optical technique utilizing the Coulter principle to determine the concentration and diameter of particles, along with zeta potential on some platforms.
TRPS measurements do however have very high concordance with TEM data" --- «MISEV2023»

讓我們來和大家說明為什麼推薦用Exoid(TRPS)取代傳統光學NTA技術的四個理由--

圖1所示TRPS是一種高度準確的方法。(A)TRPS, NTA和MALDS在確定四峰樣品中的粒徑時的比較。(B)NTA與TRPS對較大顆粒的偏倚比較。

原因1: Exoid的高精確度

很明顯的, 分析實驗的準確性非常重要, 而Exoid在準確性方面的表現相當出色。

在確定奈米粒徑方面, TRPS比NTA和MADLS(Multi-Angle Dynamic Light Scattering)原理都更有優勢, 請看下圖1A, 我們使用這三種技術上測量了四模態樣本, TRPS甚至非常輕鬆的就確定了四個不同平均粒徑的群體。

相比之下NTA完全漏掉了一個, 並且圖中其他幾個群體擠在了一起。NTA似乎無法辨識出樣品中的最大粒子, 這並非巧合。研究人員比較了NTA和TRPS, 發現NTA對大於150 nm的粒子有偏差, 而TRPS很容易就檢測到這些粒子(圖1B)。

然後是MADLS, 你可以在圖1A中看到它只是粗略測得了一個平均粒徑群體不是詳細得四個顆粒群體的分佈。對於MADLS你只會有一個模糊的概念，那就是對樣品中粒子的粒徑的大概估計而已。

這些模糊和不準確的測量並不足以對樣本進行表徵, 比如在脂質奈米粒子的樣本中, 很容易會因為潛在的奈米粒子團聚現象而忽略了粒徑大小的偏差; 或者是遺漏了腸道病毒樣本中的全部囊泡。
由於不準確而失去的發現可能是巨大的, 如果一直使用那些不準確的技術，那麼永遠都不會知道真正的實驗結果。

圖2。用TRPS進行單個粒子的分析。(A)在粒徑和濃度測量的三峰樣本中顯示三個不同粒子群體的資料。在分析後, 對不同群體資料進行人工上色; 但由於它們是同一樣本的一部分, 在“Izon Data Suite”軟體中它們將顯示為同一種顏色。(B)來自粒徑和zeta電位測量的資料, 顯示了三峰樣本中的不同粒子群體。和A一樣, 不同群體被人工上色。A和B使用了不同的樣品。(C)顯示奈米粒子和滾動迴圈擴增產物的資料, 改編自[3]。(D)資料顯示粒子空載時或裝載DNA後, 改編自[4]。

原因2: Exoid是單一個粒子的逐個即時測量分析

Exoid(TRPS)最令人印象深刻也是未被充分利用的特徵之一, 就是它能夠分析和提供"單個粒子"的詳細資訊; 與此同時, MADLS並不能準確測量到單個粒子, 而NTA只能測量到粒徑整體分佈。

能夠在單個粒子的基礎上檢測到粒徑和Zeta界達電位的能力使Exoid(TRPS)是無與倫比的, 更節省時間、成本和樣品體積量。

在圖2中的這些資料展示了在採用粒徑和濃度的測量模式時, 根據粒徑大小和粒子造成電阻的持續時間所顯示的多模態的粒子群體(圖2A); 在粒徑與Zeta界達電位測量模式所顯示出的多模態粒子群體(圖2B)。

在這裡我們展示了來自兩組不同研究人員的資料, 他們使用了粒徑和濃度資料(圖2C)[3]或粒徑和Zeta界達電位數據(圖2D)[4]來監測裝載了貨物的奈米粒子。

在單個粒子的尺度上高精度地監測奈米”貨物”裝載或粒子的聚集在奈米醫學研究中是非常寶貴的; 而EVs樣本中進行單一粒子的表徵也是非常重要的, 對於一些不同的亞群就可以用無標記的方式顯示。

此外, Exoid(TRPS)所生成的資料可以匯出各種原始數據, 在統計上可比較整個樣本或樣本內亞群的粒徑和Zeta界達電位分佈。

圖3。即時TRPS測量。(A) 當添加表面修飾劑或裝載貨物時, 需要兩個簡單步驟來測量粒子的時即變化 (B)6個資料顯示步驟A添加DNA後的Zeta potential變化

原因3: 可以即時分析樣品槽內粒子的變化

TRPS原理最大優勢之一是Exoid的樣品槽設計方式 -- 樣品不是在封閉的注射器或管道中而是在一個可開放的樣品槽中。

如圖3A所示, 將樣品添加到樣品槽後, 打開Exoid頂部的蓋子時就可隨時開發完整取出樣本, 這意味著可以將其他樣品直接加入樣品槽中觀測其反應的變化。

研究人員使用這種技術來監測將DNA載入到磁性奈米粒子上(圖3B), 結果顯示當DNA載入到粒子上時, 粒子的Zeta界達電位下降, 這不僅可以視覺化粒徑或Zeta界達電位的變化, 還可以分析裝載效率和裝載時間。

圖4。TRPS的可調性。(A) 使用TRPS進行測量攜帶SARS-COV-2病毒的小脂質粒子 (B) 使用TRPS測量大遊動孢子

原因4: 正如TRPS中"Tunable"的含義, 其是可調式的

在選擇技術和設備時, TRPS的可調節性往往會被忽漏。

奈米孔洞本身的大小從NP100(測量50 nm到330 nm)到NP4000(測量1.99 µm到11.3 µm)不等, 這意味著Exoid(TRPS)可以測量到很大範圍的粒徑大小, 從較小粒徑的EVs和脂質奈米粒子一直到較大粒徑的細菌, 甚至是一些完整的細胞, 這使得我們的奈米孔洞特別適用於"多重粒徑分散"樣品的測量, 例如不同EVs亞型的混合物和可能發生粒子聚集的奈米粒子配方。

TRPS中的Tunable實際上是指額外的可調性, 將奈米孔洞拉伸到不同的孔徑寬度,可以在不需要更換成另一種奈米孔洞的情況下對測量範圍內不同大小的粒子進行精準測量, 特別是當你不知道樣本粒徑的大小時, 只要你認為其粒徑會落在所使用奈米孔洞的粒徑上限和下限內時就可以嘗試進行測量並得到分析結果。

瞭解更多: 產品介紹 - 分析儀器 - Exoid Nanoparticle Analyzer (TRPS) 單顆粒奈米粒徑/數量濃度/Zeta膜電位分析儀

參考文獻:
1. Idris, A. et al. A SARS-CoV-2 targeted siRNA-nanoparticle therapy for COVID-19. Molecular Therapy 29, 2219-2226 (2021). https://doi.org:10.1016/j.ymthe.2021.05.004
2. Akers, J. C. et al. Comparative Analysis of Technologies for Quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). Plos One 11 (2016). https://doi.org:10.1371/journal.pone.0149866
3. Kuhnemund, M. & Nilsson, M. Digital quantification of rolling circle amplified single DNA molecules in a resistive pulse sensing nanopore. Biosensors & Bioelectronics 67, 11-17 (2015). https://doi.org:10.1016/j.bios.2014.06.040
4. Vogel, R. et al. High-Resolution Single Particle Zeta Potential Characterisation of Biological Nanoparticles using Tunable Resistive Pulse Sensing. Scientific Reports 7 (2017). https://doi.org:10.1038/s41598-017-14981-x

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