[論乳汁中的胞外體: 分離純化、功能和用途的探討]

自從上次我們分享了五種用於分離純化乳汁的胞外體方法後, 這次和大家再回頭看看一些概念: 乳汁是一種生物液體, 和其他生物液體一樣都有其特性存在, 它的產生是在各種激素的生物控制下進行的, 而其成分—雖然在物種內在的一定程度上是標準化的—但也像血液或尿液一樣會受到疾病和環境的影響。
這使得乳汁成為與人類健康有關的熱點之一, 例如: 人類母乳對嬰兒的影響和動物乳汁(如牛奶)對所有年齡的人類的影響, 其他研究的興趣包括使用乳汁的生物標記物來評估農業中的動物健康以及使用乳汁成分作為膳食藥物的傳遞載體; 雖然乳汁的研究具有巨大的潛力, 然而在某種程度上對乳汁的研究關注度並不夠, 相關研究仍依賴於瞭解這種複雜生物流體的組成部分。

  

乳汁的组成
雖然乳汁最常見的成分是乳糖和脂類, 但乳汁的成分遠不止糖和脂肪。乳汁含有完整的細胞(如免疫細胞和幹細胞[1])以及細菌細胞[2], 這兩種細胞在理論上會共同促進嬰兒腸道的健康發育[3]。乳汁的關鍵成分是脂肪球(納米到微米大小), 是由脂質核心組成, 周圍環繞著一層專門的磷脂三層膜。
蛋白質也是乳汁主要成分, 包括游離蛋白質(如抗體)和更大的結構如被稱為酪蛋白膠束的奈米酪蛋白複合物。
微量營養素(如鈣、維生素)也是牛奶的重要成分, 對牛奶的營養價值至關重要, 最後是胞外體(Extracellular vesicles, EVs)。
 
乳汁中EVs的分離純化的挑戰
如何最好地從乳汁中分離出純淨的的EVs是一個很難回答的問題, 而去除脂肪球和整個細胞卻相對容易, 當乳汁在2000 x g左右離心時, 兩者都將從含有EVs的部分中分離出來: 細胞會在試管底部成球, 脂肪球則會在試管頂部沉澱聚集[4], 接著可以將上面的脂肪球吸走, 再將剩下的上清液轉移到一個新的管中, 也可加上過濾的步驟以去除剩餘的脂肪球[4]。
使用尺寸排除色譜管柱(如qEV column)可以有效地從EVs中分離游離蛋白, 然而由於酪蛋白膠束的大小會與EVs重疊因此很難去除, 有多種方法可去除酪蛋白膠束。
首先是酸化, 這可沉澱酪蛋白膠束並允許他們被離心除去; 但缺點是這種方法也會改變了EVs的結構[5]。使用EDTA分離也可以, 儘管這也可能損害EVs [6]。
凝乳酶(又稱腎素)可以用來清除酪蛋白並使其聚集, 使酪蛋白、脂肪球和細胞通過離心一起去除[7]。為了完全確定出一個理想的實驗流程, 還需要對這些酪蛋白去除方法進行更深入的比較。

乳汁中的EVs在健康和疾病中的作用
對乳汁EVs功能的研究集中在某個方面, 在這裡我們將主要關注乳汁EVs對其直接接觸的胃腸道系統的影響。
唯一的例外是人類母乳的EVs會通過其與組織因數的關聯而促進凝血的有趣能力[8], 由於凝血能有效地密封傷口, 這種凝血特性的功能可能在與哺乳有關的乳頭創傷時可保護母親免受感染[9]; 有趣的是, 這種促凝活性被發現在牛奶中是完全沒有的[9]。
隨著世界範圍內早產兒和低出生體重嬰兒存活率的提高, 壞死性小腸結腸炎(NEC)的發病率也隨之上升, 這對這些嬰兒造成了不成比例的影響[10]。
NEC是一種腸道炎症, 通常會導致敗血症, 在感染新生兒中約有23.5%是致命的[11], 鑒於如此高的死亡率和母乳對NEC [12]的保護作用, 研究母乳-EVs的影響是一個重要的研究領域, 如果乳汁-EVs對NEC有保護作用, 那麼這些EVs就可能是供體或配方奶中的有效強化劑。
事實上情況似乎就是這樣, 在NEC小鼠模型中, 人類母乳-EVs對死亡率[14]和疾病的嚴重程度具有保護作用[15-16]。母乳-EVs保護NEC的機制可能是多模式的, 包括腸上皮細胞增殖的增加[17]、杯狀細胞功能的改善[16]和屏障密封性的改善 [18], 而乳汁-EVs也可能對成人的腸道炎症疾病有幫助[18]。
綜上所述的這些研究都強調了進一步研究乳汁-EVs對於治療和預防NEC和其他炎症性腸道疾病的重要性。
 
乳汁-EVs能到達腸道嗎?這是否使它們可成為藥物的載體?
乳汁-EVs對NEC小鼠模型的積極影響已表明了其可能會完整地到達腸道, 而嬰兒的胃腸道系統要比成人的要溫和, pH值更高消化酶的濃度更低[19-20]。
在口服給藥後的小鼠遠端器官中有發現了來自乳汁-EVs的人工裝載的內含物, 這證實了EVs可在成年小鼠的消化系統中保存[21-22]。事實上, 母乳中的EVs也可以在體外消化系統中存活並內化到所培養的腸上皮細胞中[23]。
這裡也值得注意的是, 許多過去的吸收研究依賴於膜染料來測量EVs吸收但這種標記過程可能會產生假陽性出現[24], EVs本身是否能通過腸道屏障, 或者是否有足夠水平的特定物質(如miRNAs)能被輸送到細胞中, 是還需要做進一步研究的。
抵抗消化的能力可能使乳汁-EVs成為可行的口服藥物輸送載體, 使用口服載藥乳汁EVs的體外研究就驗證了這一觀點[25], 另一些研究則是通過靜脈給老鼠注射了含有藥物的乳汁-EVs [26], 與游離的藥物相比, 這兩種途徑似乎都提高了藥物的有效性而使其成為未來研究的一個有希望的領域。

乳汁-EVs領域研究的關鍵問題
1. 如何在不改變EVs的情況下將乳汁-EVs提純到更高的標準?
在這一領域雖然已經取得了關鍵的進展但還沒有對實驗的流程進行標準化和嚴格的比較和測試, 而乳汁的收集和最初的加工對這一流程也是必不可少的。
2. 如何儲存乳汁(以及EVs)以充分保持其完整性和功能性而達到治療目的?
EVs的儲存穩定性問題是一個快速發展的領域, 這個難題的解決對於任何EVs成為一種實用的治療方式一直都是至關重要的。
3. 乳汁-EVs對長期的治療安全嗎?
雖然在短期的體內研究中表明乳汁-EVs是無毒的, 但在長期的治療過程中卻不能排除會有低水平毒素的積累, 這種毒素可能來自供體動物的環境(如農藥等化學物質)或內源性EVs的成分, 這些成分可能會在病理上影響到它們接觸到的細胞。
4. 嬰兒和成人對跨物種乳汁-EVs的耐受性如何?
研究表明非人類來源的母乳對新生兒健康的影響比人類母乳更糟, 並非所有的成年人都能接受攝食牛奶。
5. 載藥乳汁-EVs研究的良好結果能否轉化為成功的臨床試驗?
這個問題我們仍在等待與乳汁-EVs相關的首次臨床試驗。
要想解決以上這些問題就必需繼續執行乳汁-EVs的研究和遵守報告指南規定(如下圖), 該指南將由Milk Task Force在即將出版的刊物中制定出。