簡介:
胞外體(Extracellular Vesicles, EVs)由於其潛在的診斷、疾病監測和治療應用而受到越來越多的關注, 雖然不少研究已開始評估了各種生物體液中(比如血漿&細胞培養液)的EVs分離純化方法, 但這些技術應用于糞便樣品時的資料幾乎沒有。
MT-sDNA test可高靈敏度(93%)和無創檢測結直腸癌(I-III)。但是對癌前病變進展的檢測靈敏度卻低於50%, 因此非常需要補充另一個生物標記物來檢測癌前進展病變(晚期腺瘤和無蒂鋸齒狀息肉>1cm)。
EVs粒子是非常理想的生物標記物來源, 因為其內含有的核酸、蛋白和外圍脂質反映了其來源細胞的狀態。糞便是研究EVs和結直腸癌(CRC)的理想生物標本, 是因為其腔內脫落釋放到糞便中的腫瘤標誌物會早於血管侵襲, 而由於EVs的釋放是一種保守的機制, 所以糞便中的EVs也會含有細菌來源的EVs。
討論:
在這篇今年發表在JEV的研究中, 作者評估了5種常見的EVs分離方法(超離[UC]、沉澱試劑組[Original ExoQuick isolation reagent, EQ-O；ExoQuick Tissue Culture media isolation reagent, EQ-TC]、尺寸排除色譜[SEC]和超濾[UF])的總回收率、重複性、純度、RNA組成和糞便上清蛋白的表達。最後得出結論-推薦使用SEC法(文中使用的是qEVsingle 70nm column管柱)分離純化糞便樣品中的EV, 可獲得相對較高的EVs純度和較低的非EV RNA污染; 該研究也為將來使用高通量組學技術來分析糞便衍生EVs作為早期CRC檢測的新型生物標誌物奠定了基礎。
讓我們看看該研究的主要結果：
下圖(原文圖2)展現了各種分離方法的EVs電鏡圖和EVs粒徑分佈, 六種分離方法均可在電鏡下觀察到典型的EV茶託狀形態。但其實中超速離心(100,000xg, 總計4小時離心, P100K)和SEC法分離的EVs電鏡下的污染最少(圖中紅星所示)。超速離心(20,000 x g, 30 min, P20K)的電鏡背景仍有大量雜質。
接著作者評估了這些分離方法對於EVs的回收效率, 下圖(原文圖3a)顯示超濾UF法和尺寸排阻法SEC的EV回收效率最高, 分別是53%和49%。沉澱試劑組約為20%-30%, 超速離心(P100K)只有約9%。
然後作者分析了由糞便分離的EVs的組成。下圖(原文圖4)展示了各分離方法的蛋白含量(mean ±SD; μg): 199.12 ± 80.69 (UF), 13.75 ± 7.47 (SEC), 44.84 ± 34.33 (EQ-O), 54.28 ± 49.82 (EQ-TC), 17.53 ±7.40 (UC-P20K), 11.62 ± 15.76 (UC-P100K); 我們可以看到超濾和沉澱試劑組中的雜蛋白含量相對較高。下圖也展示了各分離方法的每μg雜蛋白所含EVs數量(可評估樣品中非EVs的蛋白含量); 我們可以看到SEC法和超速離心法的EVs相對更純, 每毫克蛋白所含的胞外體數量更多。
下圖c展示了使用蛋白印跡分析純化的EV中的人和細菌來源的污染。其中鈣聯結蛋白calnexin只存在於糞便上清中(SS), 說明所有分離方法均無內質網污染。在革蘭氏陰性細菌EV中, 鞭毛蛋白flagellin已被確定為鞭毛的主要亞單位。可以看到在超速離心(20,000 x g, 30 min, P20K)和沉澱法(EQ-O，EQ-TC)中都有明顯的flagellin條帶, 說明有可溶蛋白污染。
EV跨膜蛋白CD63, 人外泌體蛋白TSG101, EV胞質蛋白HSP70, 均可以在除超速離心(UC-P100K)的其他分離方法中檢測到(下圖c和e)。
儘管使用了相同體積的糞便上清液, 但最終RNA的產量(ng)卻完全不同, 依次為UF(292.36 ± 117.99)，EQ-O (91.3 ± 41.3), UC-P20k (77.35 ± 20.93), EQ-TC (63.68 ± 53.46), SEC (12.97±5.75)和UC-P100k (5.70 ± 2.29), 而這些非EVs來源的RNA可能會與EVs一同純化下來, 這會對後續研究產生干擾。
在下圖(原文圖6a)中, 作者使用Ribogreen檢測到在SEC純化的EVs區和蛋白區均有RNA存在, 這可能是由於非EVs的RNA與核糖核蛋白複合物和脂蛋白結合。接著作者用Proteinase K和RNAse A破壞EVs樣品中的RNPs, 發現UF法提取的兩個樣品EV-RNA產量下降分別為92.5%和89.3%, 而用SEC法提取的兩個樣品EV-RNA產量下降分別為78.7%和28.1% (原文圖6b和6c)。這說明了超濾UF法比SEC法帶有更多的非EVs來源的RNA。作者總結平均只有9.1%的UF法提取的RNA屬於EVs, 而有多達53.4%的SEC法提取的RNA屬於EVs。
文中最後總結, 超速離心UC-P100K僅有9%的回收效率, 儘管可調整UC離心策略使得回收效率達到30%, 但是TEM顯示不純污染物也相應增多。低速離心UC-P20K回收效率略高約為19%, 但遠遠低於UF法的53%和SEC法的49%。並且, 如果增加初始樣品量到500μL糞便上清, SEC法的回收效率在所測試分離方法中是最高的, 而UF法反而降低很多; RNA提取前的酶處理是必要的這可避免非EVs 來源的RNA污染。
參考文獻: Northrop‐Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., & Lucien, F. (2022). Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of extracellular vesicles, 11(4), e12208.
